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　　人巨细胞病毒miRNA-US33-5p及miRNA-UL36-5p靶基因的筛选和功能研究.pdf

　　目的人巨细胞病毒HUMANCYTOMEGALOVIRUS，HCMV感染在人群中普遍存在，一般呈隐性感染状态，多数感染者为健康的病毒携带者。但HCMV先天感染及免疫能力低下的人群感染，其发病率和死亡率则显著提高1，且致病机理尚不清楚。HCMV是目前唯一被证实具有编码MIRNA能力的Β疱疹病毒，研究表明，MIRNA对细胞分化、增殖、凋亡、致癌等生物过程有调节作用26。近年来，HCMV编码MIRNA对基因转录后调控的研究也成为HCMV致病机理研究的热点。迄今为止已经发现HCMV至少编码26种成熟的MIRNAS7，这些MIRNAS在HCMV感染过程中作用于MRNA使其蛋白质翻译终止甚至降解。例如MIRNAUL1121通过下调HCMVIE72UL123，IE1，UL112/113，UL120/121以及UL144的表达进而影响病毒的复制能力89同时MIRNAUL1121还可通过与人组织相容性复合体Ⅰ类相关基因BMAJORHISTOCOMPATIBILITYCOMPLEXCLASSⅠRELATEDCHAINB，MICB相互作用，从而逃避NK细胞的识别10。由此可见，HCMV利用自身编码的MIRNAS调节自身及宿主细胞的基因表达进而完成病毒复制、调节细胞周期及免疫逃避等过程。MIRUS335P和MIRUL365P是HCMV编码的MIRNAS中较早发现的两个MIRNAS。有研究指出MIRUS33可减少潜伏状态下HCMVDNA复制11，然而，其机制尚未明确。也有文献报道使用HYBRIDPCR方法筛选出SOLUTECARRIERFAMILY25，MEMBER6SLC25A6，又名腺嘌呤核苷酸转位酶ADENINENUCLEOTIDETRANSLOCATOR3，ANT3为MIRUL365P候选靶基因12。为进一步明确MIRUS335P及MIRUL365P的生物学功能，本研究拟采用HYBRIDPCR13、荧光素酶活性检测实验及免疫印迹实验WESTERNBLOT等方法来鉴定与MIRUS335P和MIRUL365P相互作用的靶基因。并针对不同靶基因的生物学功能设计不同的功能研究实验路线P在HCMV感染过程中的生物学功能。方法一、实验材料1、HCMV临床分离株HAN、HCMVHAN株细菌人工染色体HCMVHANBAC2、人胚肾细胞HEK293、人胚肺成纤维细胞MRC5和HELF、人脑神经胶质瘤细胞U3733、核酸提取相关试剂4、荧光定量PCR检测相关试剂5、构建表达载体相关试剂6、双萤光素酶报告基因检测相关试剂7、WESTERNBLOT印迹杂交相关试剂8、POWERSYBRGREENPCR检测相关试剂9、凋亡检测相关试剂10、常用实验设备包括荧光分光光度计、紫外分光光度计、酶标仪、流式细胞仪、自动凝胶成像分析仪、全温振荡培养箱等。11、常用数据库及分析软件包括基因组数据库、凝胶成像及扫描分析软件、引物设计软件PRIMER5、SPSSVERSION130等。二、实验方法人巨细胞病毒MIRUS335P靶基因的鉴定及功能研究1、采用实时荧光定量PCR方法检测HCMV感染人胚肺成纤维细胞中MIRUS335P的表达。2、采用HYBRIDPCR方法筛选HCMV感染人胚肺成纤维细胞中MIRUS335P靶基因。3、将HYBRIDPCR方法获得的靶基因以及生物信息学软件预测的靶基因的MIRUS335P结合区及其附近400BP左右的序列构建到PMIRREPORTERTMLUCIFERASE载体中，通过荧光素酶活性检测荧光值的变化判断MIRUS335P与候选靶基因3UTR的结合能力，并确定与病毒复制相关的靶基因突触融合蛋白SYNTAXIN3STX3。4、构建STX33UTR突变型荧光素酶报告基因表达载体，应用荧光素酶活性检测，进一步验证MIRUS335P与STX33UTR的直接结合作用。5、通过WESTERNBLOT方法检测MIRUS335P对HCMV感染刺激下MRC5细胞产生的内源性STX3蛋白表达水平的影响。6、利用定量PCRQPCR方法检测体外过表达MIRUS335P靶向调控STX3表达对HCMVDNA拷贝数的影响。7、绘制过表达MIRUS335P的HCMV病毒生长曲线P与病毒复制的关系。人巨细胞病毒MIRUL365P靶基因的鉴定及功能研究1、将已知的MIRUL365P候选靶基因腺嘌呤核苷酸转位酶ANT3与MIRUL365P的结合区及其附近267BP的序列构建到PMIRREPORTERTMLUCIFERASE载体中，通过荧光素酶活性检测荧光值的变化判断MIRUL365P与候选靶基因腺嘌呤核苷酸转位酶ANT33UTR的结合能力。2、构建ANT33UTR突变型荧光素酶报告基因表达载体，应用荧光素酶活性检测，进一步验证MIRUL365P对ANT33UTR的直接结合作用。3、通过WESTERNBLOT方法检测MIRUL365P对HEK293、HELF及U373等三种不同细胞系内源性表达的ANT3蛋白质水平的影响以及在HCMV感染的HELF细胞中，ANT3蛋白表达水平的差异。4、利用流式细胞术检测过表达MIRUL365P对细胞凋亡的影响。结果一、人巨细胞病毒MIRUS335P靶基因的鉴定及功能研究1、通过TAQMAN实时荧光定量PCR检测，观察到MIRUS335P的表达量随病毒培养时间的延长而逐渐增加。2、经过HYBRIDPCR筛选，共得到12个候选靶基因，涉及到免疫系统的调节、蛋白质合成、细胞周期调节、能量代谢、以及癌症发生甚至HCMV病毒复制等方面。这些候选靶基因中有2个来源于病毒基因组，另外10个均来源于宿主基因。3、荧光素酶活性检测结果显示，8个HYBRIDPCR方法获得的候选靶基因及2个预测的候选靶基因中，MIRUS335P对其中7个候选靶基因发挥负调控作用，且有统计学意义。其中与HCMV病毒复制相关的靶基因突触融合蛋白STX33UTR与MIRUS335P结合能力较强，而MIRUS335P针对STX33UTR突变型的负调控能力消失。4、对靶基因STX3进行了蛋白表达水平的检测，结果表明STX3蛋白的表达水平被MIRUS335P下调，证实STX3是MIRUS335P的直接靶基因。5、通过实时定量HCMV编码UL83基因DNA表达量的实验证实，过表达MIRUS335P能抑制HCMVDNA合成。进一步绘制了HCMV生长曲线，结果表明过表达MIRUS335P抑制HCMV复制。二、人巨细胞病毒MIRUL365P靶基因的鉴定及功能研究1、荧光素酶活性检测结果显示候选靶基因腺嘌呤核苷酸转位酶ANT3明显受到MIRUL365P的负调控，而MIRUL365P针对ANT33UTR突变型的负调控能力消失。2、对靶基因ANT3进行了蛋白表达水平的检测，结果显示HEK293、HELF及U373三种不同细胞系表达的ANT3水平均被MIRUL365P明显下调，证实ANT3是MIRUL365P的直接靶基因。3、HCMV感染下调ANT3蛋白水平，其中感染24小时下调最明显。4、流式细胞术检测发现过表达MIRUL365P靶向下调ANT3表达明显抑制饥饿诱导的三种不同细胞的凋亡。结论1、人巨细胞病毒MIRUS335P靶向作用突触融合蛋白STX33UTR特定区域，负性调控该基因的表达，进一步影响HCMVDNA合成和DNA复制。2、人巨细胞病毒MIRUL365P通过靶向作用腺嘌呤核苷酸转位酶ANT3特定区域，负性调控该基因的表达，明显抑制饥饿诱导的三种不同细胞的凋亡。

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